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Jun 01, 2023

Estudios in vitro e in vivo de plantas.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14146 (2023) Citar este artículo Detalles de métricas Los inhibidores de puntos de control inmunológico son una clase bien conocida de fármacos inmunoterapéuticos que se han utilizado para

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14146 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

Los inhibidores de puntos de control inmunológico son una clase bien conocida de fármacos inmunoterapéuticos que se han utilizado para el tratamiento eficaz de varios tipos de cáncer. Atezolizumab (Tecentriq) fue el primer anticuerpo dirigido al punto de control inmunológico PD-L1 y ahora se encuentra entre las terapias contra el cáncer más utilizadas. Sin embargo, este anticuerpo anti-PD-L1 se produce en células de mamíferos con altos costos de fabricación, lo que limita el acceso de los pacientes con cáncer al tratamiento con anticuerpos. El sistema de expresión vegetal es otra plataforma que se puede utilizar, ya que puede sintetizar glicoproteínas complejas, es rápidamente escalable y relativamente rentable. En este documento, atezolizumab se produjo de forma transitoria en Nicotiana benthamiana y demostró un alto nivel de expresión dentro de los 4 a 6 días posteriores a la infiltración. Después de la purificación mediante cromatografía de afinidad, el Atezolizumab purificado producido en plantas se comparó con Tecentriq y mostró ausencia de glicosilación. Además, el Atezolizumab producido en plantas podría unirse a PD-L1 con una afinidad comparable a Tecentriq en ELISA. También se descubrió que la actividad inhibidora del crecimiento tumoral del atezolizumab producido en plantas en ratones era similar a la de Tecentriq. Estos hallazgos confirman la capacidad de la planta para servir como plataforma de producción eficiente de anticuerpos inmunoterapéuticos y sugieren que podría usarse para aliviar el costo de los productos anticancerígenos existentes.

El cáncer es una enfermedad que se produce cuando las células tumorales crecen sin control y se diseminan a otras partes del cuerpo. Desde entonces, se ha convertido en una de las principales causas de muerte en humanos, con mayor impacto en los países en desarrollo1,2. El cáncer se trata mediante diversos métodos, que incluyen cirugía, quimioterapia, radioterapia e inmunoterapia3. Los tratamientos inmunoterapéuticos ayudan al sistema inmunológico a combatir el cáncer. Los inhibidores de puntos de control inmunológico (ICI), la terapia de transferencia celular adoptiva y las vacunas contra el cáncer se encuentran entre las principales inmunoterapias utilizadas para tratar el cáncer4.

Los ICI son anticuerpos monoclonales (mAb) que se dirigen y bloquean los puntos de control inmunológicos inhibidores como, entre otros, PD-1, PD-L1 y CTLA-45,6,7. La unión de PD-1 a las células T y de PD-L1 a las células cancerosas, por ejemplo, inhibe la destrucción de las células cancerosas por parte de las células T. Cuando la unión de PD-1/PD-L1 se bloquea con un ICI, las células T pueden matar las células cancerosas, aprovechando las propias células inmunitarias del cuerpo para atacar las células tumorales4. Los ICI solos o en combinación con otras opciones de tratamiento del cáncer han logrado un éxito significativo como tratamiento estándar en varias indicaciones del cáncer8,9,10,11. Hasta la fecha, la FDA ha aprobado siete ICI comerciales12. Sin embargo, debido al costo creciente de estos tratamientos contra el cáncer, los pacientes tienen un acceso limitado a ellos13,14.

Las proteínas recombinantes para uso humano son prohibitivamente caras debido al alto coste de fabricación. En comparación con otras plataformas de producción, la plataforma vegetal tiene muchas ventajas, incluida una producción más rápida en el caso de expresión transitoria15, escalabilidad16, costos de producción iniciales más bajos que las células de mamíferos17,18 y un menor riesgo de contaminación por patógenos humanos19. Las plantas también son capaces de realizar modificaciones postraduccionales, que son necesarias para proteínas complejas como los mAbs20. Investigaciones anteriores demostraron las capacidades de la plataforma vegetal para producir mAb recombinantes contra el Ébola21, la rabia22 y aplicaciones oncológicas23,24,25.

En este estudio, se utilizó la plataforma vegetal para producir mAb anti-PD-L1 y determinar su actividad. El atezolizumab purificado producido por plantas se caracterizó mediante SDS-PAGE y Western blot y su actividad se comparó con el mAb anti-PD-L1 comercial (Tecentriq). Los resultados mostraron que el Atezolizumab producido en plantas era ligeramente más grande que el Tecentriq. En términos de análisis funcional, el atezolizumab producido en plantas demostró resultados similares en la unión a huPD-L1 in vitro y en la reducción del peso y volumen del tumor en ratones in vivo. Nuestros datos confirman que el sistema vegetal puede producir proteínas biológicamente activas con funciones similares a las de otras plataformas bien establecidas. Más importante aún, esta plataforma tiene el potencial de reducir los costos asociados en el proceso inicial de producción de medicamentos, aumentando así el acceso de los pacientes a tratamientos biológicos.

Para generar una versión de Atezolizumab sin glicano, se mutaron tres aminoácidos (N298A, D359E y L361M) de la cadena pesada mediante PCR superpuesta. El gen se insertó en un vector geminiviral y se transformó en A. tumefaciens. Las células bacterianas transformadas que contenían cadena pesada o cadena ligera anti-PD-L1 no glicano se coinfiltraron en hojas de N. benthamiana. El nivel de expresión de proteínas se determinó mediante optimización del día. En consecuencia, las hojas infiltradas se recolectaron varios días después de la infiltración (1, 3, 4, 5, 6 y 7 ppp) y los niveles de expresión de Atezolizumab se midieron mediante ELISA tipo sándwich cuantitativo. La presencia de síntomas en el área foliar infiltrada confirma la expresión de mAb. Sin embargo, cuando se produjo necrosis en los últimos días, la expresión de atezolizumab disminuyó. El nivel de expresión más alto de atezolizumab producido en plantas produjo aproximadamente 1,8 mg/g de peso fresco en 5 ppp (Fig. 1). Se utilizaron SDS-PAGE y Western blot para comparar el extracto crudo infiltrado con el extracto crudo no infiltrado (Figuras complementarias 1 y 2). En condiciones reductoras y no reductoras, las proteínas crudas se tiñeron con colorante InstantBlue (Figura 1a complementaria) y la expresión de Atezolizumab en extracto de N. benthamiana infiltrado reveló bandas a 50 y 150 kDa usando IgG antihumana (Figura 1b complementaria). , carril 2) y a 25 y 150 kDa usando Kappa antihumano (Figura complementaria 1c, carril 2), respectivamente. Como se esperaba, estas bandas estaban ausentes en el extracto de N. benthamiana no infiltrado (Figuras complementarias 1b, c, carril 1).

Experimento de optimización del día para atezolizumab de origen vegetal. Las hojas de N. benthamiana infiltradas se recolectaron los días 1, 3, 4, 5, 6 y 7 después de la infiltración (dpi). El nivel de expresión de anticuerpos a varios ppp se calculó mediante ELISA tipo sándwich. Se proporcionaron imágenes representativas de la necrosis de las hojas y un gráfico que muestra la expresión relativa del atezolizumab producido en plantas. Los datos se presentan como media ± DE de muestras por triplicado.

El atezolizumab producido en plantas se purificó a partir del extracto crudo de N. benthamiana infiltrado mediante cromatografía de afinidad con proteína A. Las características del atezolizumab purificado producido en plantas se examinaron mediante SDS-PAGE y Western blot (Fig. 2 y Fig. complementaria 3). En condiciones no reductoras, el atezolizumab producido por plantas se detectó a 150 kDa con InstantBlue (Fig. 2a), IgG antihumana (Fig. 2c) y Kappa antihumana (Fig. 2e). En condiciones reductoras, el atezolizumab producido por plantas se observó a 50 kDa de cadena pesada y 25 kDa de cadena ligera con InstantBlue (Fig. 2b), IgG antihumana (Fig. 2d) y Kappa antihumana (Fig. 2f). ). Por otro lado, el Atezolizumab producido por plantas era ligeramente más grande, con bandas de mayor peso molecular que Tecentriq (Fig. 2, carriles 1 y 2). Los resultados de las transferencias Western sondadas con IgG antihumana y Kappa antihumana confirman la coexpresión de cadenas pesadas y ligeras, lo que da como resultado un mAb completamente ensamblado.

SDS-PAGE y análisis de transferencia Western de mAb anti-PD-L1. Tecentriq y Atezolizumab purificado producido en plantas se separaron mediante SDS-PAGE no reductor (a, cye) y reductor (b, d, f). Se cargaron aproximadamente 2 µg de mAb en SDS-PAGE y se cargaron 300 ng de mAb para análisis de transferencia Western. Los geles se tiñeron con colorante InstantBlue (a,b) o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sondaron con IgG antihumana (específica de cadena pesada) (c,d) y kappa antihumana (específica de cadena ligera) (e, F). Carril M: escalera de proteínas; carril 1: Tecentriq; carril 2: Atezolizumab purificado de origen vegetal.

La composición de N-glicano de la cadena pesada de Atezolizumab producida por plantas se analizó mediante cromatografía líquida, ionización por electropulverización y espectrometría de masas (LC-ESI-MS) y se comparó con Tecentriq. Se mutaron tres sitios en la región Fc del mAb en un intento de inhibir la N-glicosilación de nuestro mAb producido en plantas. Los hallazgos confirmaron que el Atezolizumab mutante producido por plantas carece de estructuras de glicano y sigue el mismo patrón que Tecentriq (Fig. 3).

Análisis de glicosilación de Tecentriq y Atezolizumab purificado de origen vegetal. Tecentriq y Atezolizumab purificado de origen vegetal se digirieron con tripsina y se analizaron con LC-ESI-MS.

Se determinó el reconocimiento de antígeno específico de Atezolizumab producido en plantas y se comparó con el de Tecentriq y Nivolumab23 producido en plantas mediante ELISA funcional. Tanto el Atezolizumab como el Tecentriq producidos en plantas demostraron una unión específica y comparable a la proteína huPD-L1, mientras que el Nivolumab producido en plantas no mostró unión al antígeno (Fig. 4). Estos datos confirmaron que el atezolizumab producido en plantas puede unirse a huPD-L1 in vitro y que las mutaciones triples en la región constante de la cadena pesada no tuvieron ningún efecto sobre la capacidad de unión del mAb derivado de plantas.

Afinidad de unión del atezolizumab purificado producido en plantas a la proteína huPD-L1 a 2 µg/ml. Se utilizó Tecentriq como control positivo y Nivolumab producido en plantas como control negativo. Se analizaron series de diluciones crecientes de mAb para determinar la unión de huPD-L1, que se detectó mediante kappa-HRP antihumano. Los datos se presentan como media ± DE de muestras por triplicado.

Para evaluar la eficacia inhibidora del crecimiento tumoral (TGI) del atezolizumab producido en plantas, se trasplantó por vía subcutánea un modelo de ratón BALB/c-hPD-1/hPD-L1/hCTLA-4 con células CT26 de tumor de colon de ratón que expresaban hPD-L1. El mAb anti-PD-L1 producido en plantas se administró a los ratones junto con Tecentriq como control positivo y PBS como control negativo, siguiendo el régimen predeterminado en la Fig. 5a. Los ratones recibieron 6 dosis de cada fármaco mAb a 3 mg / kg cada tres días, y se recopilaron datos sobre los volúmenes tumorales (TV) y el peso corporal del ratón hasta el día 23. Como se muestra en la Fig. 5b, los ratones en los tres grupos de tratamiento tuvieron resultados similares. pesos corporales, lo que indica buena tolerancia a la administración continua del tratamiento. El día 21, Atezolizumab (TGITV = 41,90%) y Tecentriq (TGITV = 24,59%) producidos por plantas redujeron significativamente el crecimiento de los tumores CT26-hPD-L1 en ratones en comparación con el control negativo (Tablas complementarias 1 y 2) ( P<0,05). Además, la reducción del volumen del tumor no difirió entre los grupos tratados con mAb anti-PD-L1 (Fig. 5c) (P>0,05). Al final del estudio, se eliminaron todos los ratones y se recogieron y pesaron los tumores (peso del tumor; TW). Los tamaños de los tumores en los grupos tratados con Atezolizumab producido por plantas (TGITW = 29,03%) fueron significativamente más pequeños que los del grupo de control de PBS (P <0,05), como se muestra en la Fig. 5d y la Tabla complementaria 3. Lo más importante es la eficacia antitumoral. de Atezolizumab producido en plantas no fue significativamente diferente del de su homólogo mAb producido en células de mamíferos en este modelo murino singénico de cáncer colorrectal (P > 0,05).

Eficacia antitumoral del atezolizumab producido en plantas en ratones activados con CT26-hPD-L1. Se utilizó Tecentriq como control positivo y PBS como control negativo. Se formaron tres grupos (n = 6 ratones/grupo) y se les inyectaron mAb anti-PD-L1 (3 mg/kg ip) y PBS. El cronograma para la administración de dosis y la recopilación de datos se ilustró en (a). Se demostraron efectos relacionados con el tratamiento sobre el peso corporal (b), el volumen del tumor (c) y el peso del tumor (d). Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional y se presentaron como media ± DE. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 se consideraron estadísticamente significativos.

Los inhibidores de puntos de control inmunológico (ICI) son un tipo de inmunoterapia cada vez más relevante en el tratamiento del cáncer. Estos agentes anticancerígenos han mostrado beneficios clínicos sólidos y a largo plazo, pero también son costosos14,26. El largo cronograma de investigación y desarrollo, las obligaciones financieras de los ensayos clínicos y el costo del proceso de producción son sólo algunos de los muchos factores que conducen a los precios prohibitivos de los medicamentos biofarmacéuticos. Hasta ahora, la asequibilidad de la atención del cáncer y los productos biológicos siempre ha sido una preocupación importante. Los precios de los medicamentos deben reducirse para que más pacientes, particularmente aquellos en países subdesarrollados, puedan recibir atención médica y tratamiento contra el cáncer adecuados. Al hacerlo, el costo de fabricación de los medicamentos se puede reducir maximizando las tecnologías de producción. Las plantas representan una plataforma prometedora para la producción de productos biofarmacéuticos a un costo relativamente bajo17,27,28. Tienen el potencial de producir rápidamente y en masa terapias a base de plantas con bajo riesgo de contaminación19. Las ventajas productivas y económicas de las plantas alimentaron su promesa como fábrica farmacéutica competente. Las células, tejidos o plantas enteras se encuentran entre los principales sistemas utilizados en la fabricación de proteínas recombinantes terapéuticas para aplicaciones comerciales, industriales o farmacéuticas29. Para investigar la plataforma vegetal, se utilizó como control el atezolizumab comercial (Tecentriq) producido en células de mamíferos, que es uno de los siete ICI comerciales aprobados por la FDA12, en comparación con el atezolizumab producido en N. benthamiana.

En estudios previos, los vectores geminivirales han sentado las bases para la expresión transitoria de proteínas recombinantes eficaces y mAb derivados de plantas23,30,31. Durante mucho tiempo se han considerado esfuerzos para mejorar los niveles de expresión de proteínas en plantas mediante la explotación de secuencias objetivo. El motivo de retención del retículo endoplásmico (RE), SEKDEL (Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu), por ejemplo, demostró una focalización más eficiente, lo que condujo a una mayor acumulación de proteínas en las plantas32,33. Además, el uso de señales de secreción celular, como el péptido señal murino, ha demostrado mayores niveles de mAb producidos en plantas contra el virus de la rabia, por lo que las construcciones de mAb de la rabia que portan esta secuencia señal murina se expresaron más altamente que aquellas que portan un péptido señal vegetal34. Como lo demostró nuestro estudio anterior, también se encontró un alto nivel de expresión de atezolizumab glicosilado en plantas de N. benthamiana que contienen los genes de cadena pesada y cadena ligera con un péptido señal murino en el extremo N junto con una secuencia SEKDEL en el extremo C24. De manera similar, utilizamos estos transgenes en este estudio e introdujimos mutaciones (N298A, D359E y L361M) en la cadena pesada para alterar la glicosilación normal del mAb. Nuestros resultados revelaron que el atezolizumab mutado se expresó con éxito en plantas, alcanzando las cantidades más altas hasta 1,8 mg/g de peso fresco en extractos crudos dentro de los 5 días posteriores a la infiltración, lo que concordaba con un informe anterior24. Generalmente, los vectores basados ​​en geminivirales logran una expresión transitoria de proteínas biofarmacéuticas de origen vegetal entre 2 y 6 días después de la agroinfiltración, dependiendo de la respuesta hipersensible de la hoja de la planta25,35,36.

El mAb producido en la planta se purificó y analizó aún más en busca de características fisicoquímicas y estructuras moleculares. Nuestros hallazgos muestran que las bandas de cadenas pesadas y ligeras migraron estrechamente a sus pesos moleculares esperados (50 y 25 kDa) bajo SDS-PAGE reductora y transferencia Western. Asimismo, los análisis de SDS-PAGE y de inmunotransferencia no reductores revelaron que el Atezolizumab mutado producido por la planta se ensambló completa y correctamente (150 kDa). Sin embargo, los pesos moleculares aparentes de la cadena pesada, la cadena ligera y el mAb ensamblado sintetizado por plantas fueron ligeramente mayores en comparación con Tecentriq. Este pequeño aumento de tamaño puede atribuirse a la adición de SEKDEL37,38,39 y el péptido señal murino de 19 aminoácidos40. Otra posible explicación podría deberse a la fallida escisión del péptido señal39, que no hemos confirmado. La glicosilación ligada a asparagina (N) es una modificación postraduccional común involucrada en varias funciones biológicas como el plegamiento de proteínas, la estabilidad, la actividad biológica, la interacción y otras 41,42. Las primeras etapas de la N-glicosilación de las plantas parecen estar conservadas y son similares a las de las células de mamíferos43, que generalmente ocurre en el RE44. El procesamiento de mAb N-glicano se ha convertido en un aspecto crucial en la fabricación de productos biológicos. En el caso del atezolizumab comercial (Tecentriq), la glicomodificación mediante sustitución de aminoácidos en la posición 298 (asparagina por alanina; N298A) de la cadena pesada da como resultado un mAb no glicosilado. Esta eliminación de N-glicanos reduce o anula la afinidad de unión del mAb anti-PD-L1 por los receptores Fcγ45,46. En este documento, utilizando nuestra plataforma de expresión vegetal, generamos un Atezolizumab no glicosilado incorporando mutaciones que eliminan glucanos en su región Fc y lo comparamos con Tecentriq. La glicosilación específica del sitio se analizó mediante LC-ESI-MS y no se identificaron estructuras de glicano en nuestro Atezolizumab producido en plantas. Estos hallazgos confirman la eliminación exitosa de N-glicanos después de mutaciones en el sitio de glicosilación conservado y son consistentes con los datos de mAb de referencia no glicosilados. Además, el péptido señal murino y el motivo SEKDEL fusionados con mAb producidos en plantas solo actúan como secuencias principales y dirigidas para la expresión de proteínas. Sin embargo, es bien sabido que la aglicosilación de los mAb produce agregación42, que a su vez puede inducir anticuerpos antifármaco47. Más recientemente, varios estudios intentaron producir variantes glicosiladas de Atezolizumab con la esperanza de mejorar la estabilidad y actividad de los anticuerpos48,49. Además, se introdujeron dos sustituciones de aminoácidos en las posiciones 359 (ácido glutámico por ácido aspártico; D359E) y 361 (leucina por metionina; L361M) para seguir la secuencia de proteínas de Tecentriq. Estos residuos alotípicos en IgG1 se alteraron con los aminoácidos correspondientes de IgG2, lo que dio como resultado una afinidad de unión de mAb reducida a FcγR50.

El atezolizumab producido en plantas se une específicamente a la proteína PD-L1 humana en ELISA funcional. También mostró una unión comparable con Tecentriq, mientras que Nivolumab producido en plantas no se unió al objetivo como se predijo. Estos hallazgos indican que las modificaciones de Fc no tuvieron efecto sobre la capacidad de unión al antígeno de nuestro mAb producido en plantas, de acuerdo con estudios previos24,48. En general, los resultados presentados aquí ilustran que se puede producir un mAb anti-PD-L1 funcional no glicosilado en plantas con actividad de unión específica a PD-L1. La inmunoterapia con atezolizumab se ha considerado como una opción de tratamiento de primera línea para pacientes con cáncer de pulmón metastásico51 y algunos pacientes con cáncer urotelial avanzado 52. También se ha utilizado en combinación para tratar ciertos tipos de cáncer, incluidos el de hígado, mama y colon53. 54,55. En este estudio, evaluamos la eficacia de nuestro Atezolizumab producido en plantas en un modelo de ratón singénico injertado por vía subcutánea con tumores murinos CT26-hPD-L1. Con una dosis de 3 mg/kg, nuestros hallazgos revelaron una inhibición significativa del crecimiento tumoral debido al tratamiento con mAb de origen vegetal. En particular, el Atezolizumab producido en plantas demostró una regresión similar de los volúmenes y pesos de los tumores en comparación con Tecentriq. Además, las respuestas antitumorales en los grupos tratados con mAb anti-PD-L1 difirieron significativamente de las del grupo de control con PBS. Investigaciones anteriores han demostrado que dosis altas de atezolizumab (10 mg/kg) aumentaron la actividad antitumoral in vivo48. Dicho esto, es posible que en el futuro se investiguen experimentos de aumento de dosis para nuestro Atezolizumab producido en plantas para optimizar la respuesta inhibidora del crecimiento tumoral. Por otro lado, los ratones con tumores no mostraron cambios significativos en el peso corporal en ninguno de los grupos de tratamiento, lo que indica que el tratamiento con atezolizumab producido en plantas es seguro y tolerable56.

En conclusión, hemos generado con éxito un atezolizumab anti-PD-L1 en plantas de N. bethamiana sin glicosilación en su cadena pesada. El atezolizumab producido a partir de plantas glicomodificadas tenía el mismo patrón de N-glicanos que el atezolizumab comercial aglicosilado (Tecentriq). Además, tanto el mAb de origen vegetal como Tecentriq tenían afinidades de unión al antígeno comparables al PD-L1 humano in vitro. Lo más importante es que nuestro Atezolizumab de origen vegetal es tan eficaz como Tecentriq para inhibir el crecimiento tumoral in vivo. Estos hallazgos confirman la viabilidad de las plataformas vegetales tanto para la producción biofarmacéutica como para la inmunoterapia. Si se desea, las plantas podrían considerarse como otro sistema de producción de elección, con el objetivo de reducir el costo de los medicamentos biofarmacéuticos en los países en desarrollo.

El estudio fue llevado a cabo por el CU-IBC interno (Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Chulalongkorn) siguiendo todas las pautas de bioseguridad para la biotecnología moderna. Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices/regulaciones/legislación pertinentes. Las semillas de N. benthamiana utilizadas en el presente estudio fueron donadas amablemente por el Dr. Supaart Sirikantaramas, Facultad de Ciencias de la Universidad de Chulalongkorn.

Este estudio (Protocolo Animal No. GPTAP20220128-4) fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de GemPharmatech Co., Ltd. (Nanjing, China). El cuidado y uso de animales para experimentos se realizó de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal y la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). El estudio cumple con las recomendaciones de las directrices ARRIVE.

Los genes de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) de Atezolizumab que portan un péptido señal murino N-terminal y un péptido SEKDEL C-terminal se habían obtenido previamente24. Brevemente, las secuencias que codifican los genes para HC y LC se optimizaron in silico con codones de N. benthamiana mediante Invitrogen GeneArt Gene Synthesis (Thermo Scientifc, EE. UU.). Los dominios variables de Atezolizumab HC y LC se sintetizaron comercialmente y se fusionaron por separado con los dominios constantes de la cadena gamma o kappa de IgG1 humana, respectivamente. Aquí, se incorporaron múltiples sustituciones de nucleótidos en la secuencia codificante de HC mediante el método de PCR superpuesto (N298A, D359E y L361M) para generar un atezolizumab no glicosilado (NGAte) con las mutaciones deseadas. Los cebadores utilizados para introducir mutaciones puntuales específicas en Atezolizumab HC se enumeran en la Tabla 1. El producto HC mutado resultante se confirmó mediante secuenciación. Tanto las construcciones de Atezolizumab HC como LC se digirieron con las enzimas de restricción XbaI y SacI (BioLabs, Massachusetts, EE. UU.) y se subclonaron en el vector geminiviral pBY2eK (proporcionado por el profesor Hugh Mason30). Se utilizó la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens para la transformación bacteriana.

Las células de A. tumefaciens que contenían pBY2eK-NGAte-HC y pBY2eK-Ate-LC se cultivaron en medio Luria Bertani (LB) (HiMedia Laboratories, Mumbai, India) suplementado con kanamicina (50 mg/l), gentamicina (50 mg/l). ) adquirido en AppliChem, Dermstadt, Alemania, y rifampicina (25 mg/L) adquirido en TOKU-E, Washington, EE. UU. Los cultivos bacterianos se cultivaron durante la noche a 28 °C con agitación continua (200 rpm) y se diluyeron hasta una DO600 de 0,2 en tampón de infiltración (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) 10 mM, pH 5,5, MgSO4 10 mM). Luego, las bacterias se mezclaron en una proporción de 1:1 y se coagroinfiltraron en plantas de N. benthamiana de 6 a 8 semanas de edad mediante infiltración con jeringa (a pequeña escala) o infiltración al vacío (a gran escala). Las plantas infiltradas se incubaron en una sala de plantas controlada y se cosecharon los días 1, 3, 4, 5, 6 y 7 después de la agroinfiltración para examinar los niveles de expresión de mAb dependientes del tiempo. Las hojas se extrajeron con 1×PBS y luego se centrifugaron a 24.000×g durante 15 min. Las concentraciones de mAb en muestras crudas se cuantificaron analizando el sobrenadante en ELISA tipo sándwich. Para los experimentos de purificación realizados aquí, las plantas infiltradas se recogieron en el momento óptimo de cosecha de producción máxima de mAb y se homogeneizaron. El atezolizumab producido en plantas se purificó mediante cromatografía de afinidad con proteína A, como se describió anteriormente 23.

Se llevaron a cabo ensayos de SDS-PAGE y de transferencia Western para confirmar el tamaño y el ensamblaje del mAb anti-PD-L1 elaborado en plantas. Las muestras de proteínas que incluían extracto crudo no infiltrado, extracto crudo agroinfiltrado, Atezolizumab purificado producido por plantas y Tecentriq (Roche, Suiza) se mezclaron con colorante de carga no reductor (Tris-HCl 125 mM, pH 6,8, 12 % (p/v). ) SDS, glicerol al 10 % (v/v), azul de bromofenol al 0,001 % (p/v)) o tinte de carga reductor (tinte de carga no reductor con 22 % (v/v) de β-mercaptoetanol). Las muestras se separaron en gel de poliacrilamida al 4-15 % y se visualizaron mediante InstantBlue (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Para el análisis de transferencia Western, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad, Massachusetts, EE. UU.). La membrana se bloqueó con leche desnatada al 5% (p/v) en 1xPBS. Se utilizaron Kappa-HRP antihumano de cabra (SouthernBiotech, Alabama, EE. UU.) a 1:5.000 e IgG-HRP antihumano de cabra (SouthernBiotech, Alabama, EE. UU.) a 1:10.000 en leche desnatada al 3% (p/v). anticuerpos de detección. Las transferencias se revelaron utilizando sustrato ECL (Promega, Wisconsin, EE. UU.) y se expusieron a una película de rayos X (Carestream, Nueva York, EE. UU.).

La concentración de mAb en muestras crudas y purificadas se calculó mediante ELISA tipo sándwich cuantitativo. Se recubrió una placa de microtitulación de media área y 96 pocillos (Corning, Nueva York, EE. UU.) con IgG Fc antihumano de cabra (Abcam, Cambridge, Reino Unido) durante la noche a una dilución 1:1000 en PBS 1x. El lavado de la placa se realizó con 1 x PBS-T (1 x PBS con 0,05 % de Tween 20) y el bloqueo se realizó con 5 % (p/v) de leche desnatada en 1 x PBS. Se incubaron muestras de plantas diluidas en serie y estándar de anticuerpos de isotipo kappa IgG1 humano (Abcam, Cambridge, Reino Unido) en placas recubiertas durante 2 h a 37 °C, seguido de la detección con Kappa-HRP antihumano de cabra (SouthernBiotech, Alabama, EE. UU.) a 1:3.000 en 1×PBS. Finalmente, se añadió un sustrato de solución de TMB (Promega, Wisconsin, EE. UU.) y la reacción se inactivó con H2SO4 1 M. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector de microplacas NS-100 Nano Scan (Hercuvan, Shah Alam. Malasia).

Atezolizumab y Tecentriq de producción vegetal se separaron mediante SDS-PAGE reductora. La banda de cadena pesada se cortó, se alquiló en S y se digirió con tripsina. Luego, el péptido digerido se analizó mediante cromatografía líquida-ionización por electropulverización-espectrometría de masas (LC-ESI-MS), como se describió anteriormente57.

La capacidad de unión del atezolizumab producido en plantas al PD-L1 humano se investigó en un ELISA de unión a antígeno funcional. Se recubrió una placa de microtitulación de media área y 96 pocillos (Corning, Nueva York, EE. UU.) con proteína huPD-L1 recombinante (R&D System, Minneapolis, EE. UU.) durante la noche a 2 µg/ml en PBS 1x. Luego, la placa se lavó con 1x PBS-T y se bloqueó con leche desnatada al 5% (p/v) en 1x PBS. Atezolizumab, Tecentriq estándar y control de Nivolumab producidos en plantas23 se diluyeron en serie y se incubaron en la placa recubierta durante 2 h a 37 °C. La detección se realizó con Kappa-HRP antihumano de cabra (SouthernBiotech, Alabama, EE. UU.) a 1: 3000 en PBS 1 × y la actividad peroxidasa se determinó mediante un sustrato de solución TMB (Promega, Wisconsin, EE. UU.). El desarrollo del color se controló y se detuvo con H2SO4 1 M. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector de microplacas NS-100 Nano Scan (Hercuvan, Shah Alam. Malasia).

GemPharmatech Co., Ltd proporcionó y desarrolló ratones hembra activados (cepa BALB/c-hPD-1/hPD-L1/hCTLA-4), con licencia de uso de animales experimentales (SYXK (SU) 2018-0027) y Licencia de producción animal (SCXK (SU) 2018-0008). Brevemente, las secuencias codificantes de las regiones extracelulares de PD-1, PDL-1 y CTLA-4 se reemplazaron con contrapartes humanas mediante tecnología CRISPR/Cas9 en un fondo BALB/c (Figuras complementarias 4 a 6). La expresión de hPD-1, hPDL-1 y hCTLA-4 se puede detectar en esta cepa (Figura complementaria 7). Además, no se observó ninguna diferencia obvia en la proporción de células T/B/NK entre los ratones de tipo salvaje y los humanizados (Figura complementaria 8). Por tanto, esta cepa puede utilizarse para evaluar fármacos antitumorales.

La línea celular de cáncer de colon murino CT26 se adquirió de ATCC (Virginia, EE. UU.). La línea celular CT26-hPDL-1 se desarrolló desactivando el gen PD-L1 de ratón utilizando tecnología CRISPR/Cas9 e insertando un gen PD-L1 humano expresado constitutivamente. Las células se cultivaron en medios Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640, Gibco, NY, EE. UU.), suplementados con suero bovino fetal al 10 % (ExCell Bio, Shanghai, China), penicilina/estreptomicina al 0,1 % (Amresco, Ohio, EE. UU. ) antibióticos y 200 μg/ml de G418 (Gibco, Nueva York, EE. UU.). Las células libres de micoplasma se descongelaron y cultivaron a 37ºC y 5% de CO2. Luego, se recogieron células CT26-hPDL-1 (Pasaje: Pn+12) y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS; Gibco, NY, EE. UU.). La viabilidad celular se calculó antes y después de la inoculación y resultó ser del 97,14% y 95,17%, respectivamente. En este estudio, a cada ratón humanizado de entre 6 y 8 semanas de edad se le inyectaron por vía subcutánea 1.106 células CT26-hPD-L1 en el flanco derecho. Todos los ratones (n=18) se separaron aleatoriamente en grupos (n=6 ratones/grupo) cuando el tumor alcanzó un diámetro de 100 mm3. Los grupos de tratamiento recibieron Atezolizumab de origen vegetal (3 mg/kg) o Tecentriq (3 mg/kg). El régimen consta de fármacos de anticuerpos intraperitoneales (ip) cada 3 días hasta por 6 dosis (Q3D×6). A los ratones del grupo del vehículo se les inyectó 1xPBS. El efecto del tratamiento se determinó mediante el seguimiento dos veces por semana del volumen del tumor y el peso corporal del ratón. Todos los ratones fueron eliminados el día 23. En este momento, se recogieron los tumores para su posterior análisis. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (Media ± DE) y se analizan mediante una prueba ANOVA unidireccional.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado como información complementaria.

Torre, LA, Siegel, RL, Ward, EM y Jemal, A. Tasas y tendencias globales de incidencia y mortalidad del cáncer: una actualización. Epidemiol del cáncer. Biomarca. Anterior. 25, 16-27. https://doi.org/10.1158/1055-9965.EPI-15-0578%JCancerEpidemiology,Biomarkers&Prevention (2016).

Artículo de Google Scholar

Curado, MP, Boffetta, P., Schottenfeld, D., Dangou, J.-M. & Ribeiro, KB Carga del cáncer en países de ingresos bajos y medios en Epidemiología del cáncer: países de ingresos bajos y medios y poblaciones especiales (eds Amr Soliman, David Schottenfeld y Paolo Boffetta) 3–24 (Oxford University Press, 2013 ).

Zaigham, A. y Sakina, R. Una descripción general de las modalidades de tratamiento del cáncer en neoplasias (ed Shahzad Hafiz Naveed) Cap. 6 (IntechOpen, 2018).

Waldman, AD, Fritz, JM y Lenardo, MJ Una guía para la inmunoterapia contra el cáncer: desde la ciencia básica de las células T hasta la práctica clínica. Nat. Rev. Immunol. 20, 651–668. https://doi.org/10.1038/s41577-020-0306-5 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Seidel, JA, Otsuka, A. y Kabashima, K. Terapias anti-PD-1 y Anti-CTLA-4 en el cáncer: mecanismos de acción, eficacia y limitaciones. Frente. Oncol. 8, 86. https://doi.org/10.3389/fonc.2018.00086 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

He, X. & Xu, C. Señalización de puntos de control inmunológico e inmunoterapia contra el cáncer. Resolución celular. 30, 660–669. https://doi.org/10.1038/s41422-020-0343-4 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Topalian, SL, Drake, CG y Pardoll, DM Bloqueo de puntos de control inmunológico: un enfoque de denominador común para la terapia contra el cáncer. Célula cancerosa 27, 450–461. https://doi.org/10.1016/j.ccell.2015.03.001 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Santín, AD et al. Evaluación de fase II de nivolumab en el tratamiento del cáncer de cuello uterino persistente o recurrente (NCT02257528/NRG-GY002). Ginecol. Oncol. 157, 161–166. https://doi.org/10.1016/j.ygyno.2019.12.034 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rischin, D. y col. Bloqueo de PD-1 en cáncer de cuello uterino recurrente o metastásico: datos de cohortes de expansión de fase I de cemiplimab y caracterización de la expresión de PD-L1 en cáncer de cuello uterino. Ginecol. Oncol. 159, 322–328. https://doi.org/10.1016/j.ygyno.2020.08.026 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Savoia, P., Astrua, C. & Fava, P. Ipilimumab (Anti-Ctla-4 Mab) en el tratamiento del melanoma metastásico: eficacia y manejo de la toxicidad. Tararear. Vacuna. Inmunotro. 12, 1092-1101. https://doi.org/10.1080/21645515.2015.1129478 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Lheureux, S. y col. Un estudio de fase 1/2 de ipilimumab en mujeres con carcinoma cervical metastásico o recurrente relacionado con el VPH: un estudio de los consorcios Princess Margaret y Chicago N01. Anales de Oncología 32, TPS5631 – TPS5631. https://doi.org/10.1200/jco.2014.32.15_suppl.tps5631 (2014).

Artículo de Google Scholar

Hargadon, KM, Johnson, CE y Williams, CJ Terapia de bloqueo de puntos de control inmunológico para el cáncer: una descripción general de los inhibidores de puntos de control inmunológico aprobados por la FDA. En t. Inmunofarmacol. 62, 29–39. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2018.06.001 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tartari, F. y col. Sostenibilidad económica de los agentes anti-PD-1 nivolumab y pembrolizumab en pacientes con cáncer: conocimientos recientes y desafíos futuros. Tratamiento del cáncer. Apocalipsis 48, 20–24. https://doi.org/10.1016/j.ctrv.2016.06.002 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Andrews, A. Tratamiento con inhibidores de puntos de control: cifra de 1 millón de dólares por paciente. Soy. Beneficio de medicamentos para la salud. 8, 9 (2015).

Google Académico

D'Aoust, M.-A. et al. La producción de partículas similares a virus a base de hemaglutinina en plantas: una respuesta rápida, eficiente y segura a la influenza pandémica. Biotecnología vegetal. J. 8, 607–619. https://doi.org/10.1111/j.1467-7652.2009.00496.x (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Buyel, JF y Fischer, R. Los modelos predictivos para la expresión transitoria de proteínas en el tabaco (Nicotiana tabacum L.) pueden optimizar el tiempo del proceso, el rendimiento y los costos posteriores. Biotecnología. Bioeng. 109, 2575–2588. https://doi.org/10.1002/bit.24523 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nandi, S. y col. Análisis tecnoeconómico de una plataforma vegetal transitoria para la producción de anticuerpos monoclonales. MAbs 8, 1456–1466. https://doi.org/10.1080/19420862.2016.1227901 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mir-Artigues, P. et al. Un modelo tecnoeconómico simplificado para el farming molecular de anticuerpos. Biotecnología. Bioeng. 116, 2526–2539. https://doi.org/10.1002/bit.27093 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chen, Q. & Davis, KR El potencial de las plantas como sistema para el desarrollo y producción de productos biológicos humanos. F1000Research https://doi.org/10.12688/f1000research.8010.1 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Fischer, R., Stoger, E., Schillberg, S., Christou, P. y Twyman, RM Producción de productos biofarmacéuticos a base de plantas. actual. Opinión. Biol vegetal. 7, 152-158. https://doi.org/10.1016/j.pbi.2004.01.007 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Huang, Z. y col. Producción rápida de alto nivel de anticuerpos monoclonales de tamaño completo en plantas mediante un sistema de replicón de ADN de un solo vector. Biotecnología. Bioeng. 106, 9-17. https://doi.org/10.1002/bit.22652 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ambos, L. et al. Producción, caracterización y especificidad del antígeno del 62–71-3 recombinante, un anticuerpo monoclonal candidato para la profilaxis de la rabia en humanos. FASEB J. 27, 2055–2065. https://doi.org/10.1096/fj.12-219964 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rattanapisit, K. et al. Análisis estructurales y funcionales in vitro de nuevos anticuerpos anti-PD1 humanos producidos en plantas. Ciencia. Rep. 9, 15205. https://doi.org/10.1038/s41598-019-51656-1 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Phetphoung, T. y col. Expresión del anticuerpo anti-PD-L1 producido por plantas con actividad sensibilizante de anoikis en células de cáncer de pulmón humano mediante supresión de la transición epitelial-mesenquimatosa. Más uno 17, e0274737. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0274737 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Phakham, T. y col. Caracterización funcional de pembrolizumab producido en Nicotiana benthamiana mediante un sistema de expresión transitorio rápido. Frente. Ciencia vegetal. https://doi.org/10.3389/fpls.2021.736299 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Makurvet, FD Biologics versus moléculas pequeñas: costos de medicamentos y acceso de los pacientes. Medicina. Descubrimiento de drogas. 9, 100075. https://doi.org/10.1016/j.medidd.2020.100075 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Kaufman, J. & Kalaitzandonakes, N. El potencial económico de los productos farmacéuticos de origen vegetal en la fabricación de productos farmacéuticos biológicos. J. Comer. Biotecnología. 17, 173–182. https://doi.org/10.1057/jcb.2010.37 (2011).

Artículo de Google Scholar

Yao, J., Weng, Y., Dickey, A. y Wang, KY Plantas como fábricas de productos farmacéuticos para humanos: aplicaciones y desafíos. En t. J. Mol. Ciencia. 16, 28549–28565. https://doi.org/10.3390/ijms161226122 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tschofen, M., Knopp, D., Hood, E. & Stöger, E. Cultivo molecular de plantas: mucho más que medicamentos. Anal Rev. Anual. Química. 9, 271–294. https://doi.org/10.1146/annurev-anchem-071015-041706 (2016).

Artículo de Google Scholar

Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W. & Mason, HS Vectores geminivirales basados ​​en el virus del enanismo amarillo del frijol para la producción de antígenos de vacunas y anticuerpos monoclonales en plantas. Tararear. Vacuna. 7, 331–338. https://doi.org/10.4161/hv.7.3.14262 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Diamos, AG & Mason, HS La modificación de la replicación de vectores geminivirales reduce la muerte celular y mejora la expresión de proteínas biofarmacéuticas en las hojas de Nicotiana benthamiana. Frente. Ciencia vegetal. https://doi.org/10.3389/fpls.2018.01974 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Schouten, A. y col. La secuencia KDEL C-terminal aumenta el nivel de expresión de un anticuerpo monocatenario diseñado para apuntar tanto al citosol como a la vía secretora en el tabaco transgénico. Planta Mol. Biol. 30, 781–793. https://doi.org/10.1007/bf00019011 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Petruccelli, S. y col. Un anticuerpo monoclonal marcado con KDEL se retiene eficazmente en el retículo endoplásmico de las hojas, pero se secreta parcialmente y se clasifica en vacuolas de almacenamiento de proteínas en las semillas. Biotecnología vegetal. J. 4, 511–527. https://doi.org/10.1111/j.1467-7652.2006.00200.x (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tsekoa, TL y cols. Actividad eficiente in vitro e in vivo de los anticuerpos monoclonales contra la rabia E559 y 62–71–3 producidos por plantas mediante ingeniería genética. MÁS UNO 11, e0159313. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159313 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Siriwattananon, K. et al. Desarrollo de la proteína de fusión ACE2-Fc recombinante producida por plantas como posible agente terapéutico contra el SARS-CoV-2. Frente. Ciencia vegetal. 11, 604663. https://doi.org/10.3389/fpls.2020.604663 (2020).

Artículo PubMed Google Scholar

Boonyayothin, W., Kobtrakul, K., Khositanon, P., Vimolmangkang, S. y Phoolcharoen, W. Desarrollo de un anticuerpo monoclonal recombinante producido en plantas contra Δ-9-tetrahidrocannabinol (Δ9-THC) para aplicación de inmunoensayo. Biotecnología. Rep. 34, e00725. https://doi.org/10.1016/j.btre.2022.e00725 (2022).

Artículo CAS Google Scholar

Zagouras, P. & Rose, JK Las secuencias SEKDEL carboxi-terminales retardan pero no retienen dos proteínas secretoras en el retículo endoplásmico. J. Biol celular. 109, 2633–2640. https://doi.org/10.1083/jcb.109.6.2633 (1989).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Arakawa, T., Chong, DKX y Langridge, WHR Eficacia de una vacuna oral de subunidad B de la toxina del cólera a base de plantas alimenticias. Nat. Biotecnología. 16, 292–297. https://doi.org/10.1038/nbt0398-292 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Arakawa, T., Yu, J. y William, L. Síntesis de una proteína de fusión NSP4 de la subunidad B de la toxina del cólera y el rotavirus en papa. Representante de células vegetales 20, 343–348. https://doi.org/10.1007/s002990000312 (2001).

Artículo CAS Google Scholar

Shanmugaraj, B., Rattanapisit, K., Manopwisedjaroen, S., Thitithanyanont, A. y Phoolcharoen, W. Los anticuerpos monoclonales B38 y H4 producidos en Nicotiana benthamiana neutralizan el SARS-CoV-2 in vitro. Frente. Ciencia vegetal. 11, 589995. https://doi.org/10.3389/fpls.2020.589995 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Moremen, KW, Tiemeyer, M. & Nairn, AV Glicosilación de proteínas de vertebrados: diversidad, síntesis y función. Nat. Rev. Mol. Biol celular. 13, 448–462. https://doi.org/10.1038/nrm3383 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mimura, Y. et al. La influencia de la glicosilación en la estabilidad térmica y la expresión de la función efectora de la IgG1-Fc humana: propiedades de una serie de glicoformas truncadas. Mol. Inmunol. 37, 697–706. https://doi.org/10.1016/s0161-5890(00)00105-x (2000).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Strasser, R. Glicosilación de proteínas vegetales. Glicobiología 26, 926–939. https://doi.org/10.1093/glicob/cww023 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gomord, V. et al. La secuencia HDEL C-terminal es suficiente para la retención de proteínas secretoras en el retículo endoplasmático (ER), pero promueve la focalización vacuolar de proteínas que escapan del ER. Planta J. Cell Mol. Biol. 11, 313–325. https://doi.org/10.1046/j.1365-313x.1997.11020313.x (1997).

Artículo CAS Google Scholar

Escudos, RL y col. Mapeo de alta resolución del sitio de unión en IgG1 humana para FcγRI, FcγRII, FcγRIII y FcRn y diseño de variantes de IgG1 con unión mejorada al FcγR*. J. Biol. Química. 276, 6591–6604. https://doi.org/10.1074/jbc.M009483200 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tao, MH & Morrison, SL Estudios de IgG quimérica de ratón-humana aglicosilada. Papel de los carbohidratos en la estructura y funciones efectoras mediadas por la región constante de IgG humana. J. Inmunol. 143, 2595–2601 (1989).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lundahl, MLE, Fogli, S., Colavita, PE y Scanlan, EM La agregación de proteínas terapéuticas mejora su inmunogenicidad: causas y estrategias de mitigación. Química RSC. Biol. 2, 1004-1020. https://doi.org/10.1039/d1cb00067e (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, M. y col. Atezolizumab anti-PD-L1 de próxima generación con eficacia antitumoral mejorada in vivo. Ciencia. Rep. 11, 5774. https://doi.org/10.1038/s41598-021-85329-9 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goletz, C. y col. El anticuerpo anti-ligando de muerte programada 1 humano diseñado con glicodiseño media una activación más fuerte de las células T CD8 que sus contrapartes glicosiladas y no glicosiladas normales. Frente. Inmunol. 9, 1614. https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01614 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stapleton, Nuevo México y col. Reducción de la transcitosis de IgG2 mediada por FcRn debido a la falta de glicina en su bisagra inferior. Ciencia. Rep. 9, 7363. https://doi.org/10.1038/s41598-019-40731-2 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Seetharamu, N., Preeshagul, IR & Sullivan, KM Nuevos inhibidores de PD-L1 en el cáncer de pulmón de células no pequeñas: impacto de atezolizumab. Cáncer de pulmón 8, 67–78. https://doi.org/10.2147/lctt.S113177 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Crist, M. & Balar, A. Atezolizumab en el carcinoma urotelial invasivo y metastásico. Experto. Rev. Clin. Farmacéutico. 10, 1295-1301. https://doi.org/10.1080/17512433.2017.1389275 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Liu, X., Lu, Y. & Qin, S. Atezolizumab y bevacizumab para el carcinoma hepatocelular: mecanismo, farmacocinética y estrategias de tratamiento futuras. Oncología futura 17, 2243–2256. https://doi.org/10.2217/fon-2020-1290 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Shen, Z., Zhu, B., Li, J. y Qin, L. Rhein aumenta los efectos antiproliferativos de atezolizumab basándose en la regresión del cáncer de mama (4T1). Planta Med. 85, 1143-1149. https://doi.org/10.1055/a-1012-7034 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tapia Rico, G. & Price, TJ Atezolizumab para el tratamiento del cáncer colorrectal: la evidencia más reciente y el potencial clínico. Opinión de expertos. Biol. El r. 18, 449–457. https://doi.org/10.1080/14712598.2018.1444024 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chapman, K. y col. Una iniciativa global de una compañía farmacéutica: un enfoque basado en evidencia para definir el límite superior de pérdida de peso corporal en estudios de toxicidad a corto plazo. Regul. Toxico. Farmacéutico. 67, 27–38. https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2013.04.003 (2013).

Artículo PubMed Google Scholar

Strasser, R. y col. Generación de Nicotiana benthamiana genéticamente modificada para la producción de anticuerpos monoclonales con una estructura de N-glicano homogénea similar a la humana. Planta. Biotecnología. J. 6, 392–402. https://doi.org/10.1111/j.1467-7652.2008.00330.x (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

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Esta investigación fue apoyada por el Consejo Nacional de Investigación de Tailandia y Baiya Phytopharm Co., Ltd. El financiador no participó en el diseño del estudio, la recopilación, el análisis, la interpretación de los datos, la redacción de este artículo ni la decisión de enviarlo para su publicación. . Este estudio cuenta además con el respaldo de la espectroscopia de masas de la instalación central de BOKU.

Baiya Phytopharm Co., Ltd., Bangkok, Tailandia

Kaewta Rattanapisit

Centro de Excelencia en Productos Farmacéuticos de Producción Vegetal, Universidad Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Tailandia

Christine Joy I. Bulaon y el guerrero Phoolcharoen

Departamento de Farmacognosia y Botánica Farmacéutica, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad Chulalongkorn, Bangkok, 10330, Tailandia

Christine Joy I. Bulaon y el guerrero Phoolcharoen

Departamento de Genética Aplicada y Biología Celular, Universidad de Recursos Naturales y Ciencias de la Vida, Muthgasse 18, 1190, Viena, Austria

Richard Strasser

GemPharmatech Co., Ltd, Nankín, China

sol hongyan

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WP concibió los experimentos, KR y CJIB realizaron clonación de genes, SDS-PAGE y análisis de transferencia Western, cuantificación de anticuerpos y ensayo de unión a PD-L1, RS realizó un experimento de N-glicano y HS realizó un estudio de eficacia antitumoral. Todos los autores analizaron los resultados y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Waranyoo Phoolcharoen.

WP de la Universidad de Chulalongkorn es fundador/accionista de Baiya Phytopharm Co., Ltd. Tailandia. KR es empleado de Baiya Phytopharm Co., Ltd. HS es empleado de GemPharmatech Co., Ltd. Los autores restantes no tienen intereses financieros en competencia. No existen intereses no económicos relevantes que declarar.

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Rattanapisit, K., Bulaon, CJI, Strasser, R. et al. Estudios in vitro e in vivo de atezolizumab producido en plantas como posible anticuerpo inmunoterapéutico. Representante científico 13, 14146 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41510-w

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Recibido: 01 de abril de 2023

Aceptado: 28 de agosto de 2023

Publicado: 29 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41510-w

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